آیا وسترن بلات شما شبیه کسی است که روی خمیر سیاه نشسته است؟ اگر از وسترن لکه دار یا بد دیگری گلایه دارید، نگران نباشید. علت اغلب می‌تواند یک انتقال ضعیف باشد که به راحتی می‌توان با بهینه‌سازی انتقال‌های وسترن بلات اصلاح کرد.
در اینجا سه نکته برای بهینه سازی انتقال وسترن بلات ارائه شده است تا بتوانید لکه های تمیز ثابتی دریافت کنید.
پشته انتقال شامل چه قطعاتی است؟
قبل از بحث در مورد راه‌های بهینه‌سازی انتقال وسترن بلات، ارزش دارد که با بخش‌های پشته انتقال آشنا شوید. تصویر ساده را در شکل 1 در زیر ببینید.
دانستن قطعات پشته نیز شما را به دانشمند بهتری تبدیل می کند، که هرگز چیز بدی نیست!
این به این دلیل است که خود پشته می تواند منجر به انتقال بد شود. به عنوان مثال، هنگامی که دستگاه انتقال با نمک های بافر پوشانده شده است. اگر متوجه شدید آن را با یک کاغذ مرطوب پاک کنید.
از بالا به پایین، قطعات به شرح زیر است:
- کاتد (با بار منفی).
- کاغذ فیلتر.
- ژل SDS-PAGE شما قبل از آزمایش.
- غشای انتقال
- یه کاغذ صافی دیگه
- آند (با بار مثبت).
دو نکته کلیدی دیگر در اینجا قابل ذکر است. انتخاب غشا و بافر انتقال.
انتخاب غشاء
شما معمولاً بین دو غشا انتقالی انتخاب دارید: غشاهای نیتروسلولزی و غشاهای پلی وینیلیدین فلوراید (PVDF).
انتخاب بین آنها به انتخاب بین ظرفیت اتصال در مقابل پس زمینه بستگی دارد. غشاهای PVDF می توانند پروتئین های بیشتری را نسبت به غشاهای نیتروسلولزی متصل کنند، اما ممکن است منجر به پس زمینه بالاتر شوند.
شما همچنین می توانید اندازه منافذ را انتخاب کنید، بنابراین مطمئن شوید که برای اندازه پروتئین شما مناسب است. اگرچه 0.45 میکرومتر برای اکثر پروتئین ها کافی است، اما اگر با پروتئین های کوچکتر کار می کنید، ممکن است اندازه منافذ کوچکتر مورد نیاز باشد.
حتماً این مقاله را بررسی کنید که تفاوت بین این دو غشا را با جزئیات توضیح می دهد.
بافر انتقال
بسته به نوع انتقالی که انجام می دهید، پشته انتقال معمولاً با یک بافر انتقال شسته می شود.
احتمالاً در آزمایشگاه خود یک دستور العمل استاندارد برای این کار دارید. اما پذیرای این ایده باشید که این بافر ممکن است مناسب نباشد مال شما نمونه ها
طراحی یک بافر انتقال هدفمند می تواند کاملاً فنی باشد. خوشبختانه، Bio-Rad مقاله ای در مورد بافرهای انتقال، ترکیب و سازگاری آنها دارد.
حال بیایید به انواع مختلف انتقال در وسترن بلات نگاه کنیم.
روش های مختلف انتقال در وسترن بلاتینگ چیست؟
در حال حاضر یک مقاله عالی در Bitesize Bio وجود دارد که روش های مختلف انتقال در وسترن بلات را مورد بحث قرار می دهد. بنابراین، من فقط یادداشت های تخت را به شما می دهم.
سه راه اصلی برای انتقال پروتئین در وسترن بلات وجود دارد:
- روش استاندارد انتقال مرطوب
- روش انتقال نیمه خشک/سریع
- روش انتقال مویرگی
روش انتقال مرطوب در اکثر آزمایشگاه ها استفاده می شود و احتمالاً همان روشی است که شما استفاده می کنید. پشته را به صورت دستی در یک بافر انتقال (خیلی مرطوب) خیس می کنید و خودتان آن را در یک ساندویچ انتقال جمع می کنید.
انتقال نیمه خشک/سریع شامل خرید اجزای ساندویچ انتقال از پیش مرطوب و استفاده از آنها با دستگاه های انتقال اختصاصی مانند iBlot™ است. بنابراین گرانتر از انتقال مرطوب است.
انتقال مویرگی برای انتقال نمونه‌های شما از ژل SDS-PAGE به جای جریان الکتریکی به غشای جاذب متکی به انتشار است. از آنجایی که دستگاه انتقال مرطوب اکنون نسبتاً ارزان است، روش انتقال مویرگی تا حدودی قدیمی است.
چه مدت باید وسترن بلات خود را انتقال دهم؟
زمان های انتقال تجربی و بر اساس ویژگی های نمونه های شما است. به عنوان مثال، وزن مولکولی و آبگریزی بر حفظ پروتئین تأثیر می گذارد.
این بدان معنی است که هیچ راه آسانی برای تعیین مدت زمان انتقال شما وجود ندارد به طور کامل تمام پروتئین های خود را انتقال دهید
در عوض، شما باید زمان و شرایط انتقال را بر اساس تجهیزات و ماهیت نمونه خود بهینه کنید.
اما چگونه متوجه خواهید شد که انتقال شما تکمیل شده است؟ خوب، این ما را به نکات انتقال خود می‌رساند زیرا به شما امکان می‌دهند تا انتقال‌های وسترن بلات خود را برای دستیابی به انتقال تقریباً کامل بهینه کنید.
بیایید وارد آنها شویم.
3 نکته برای بهینه سازی انتقال وسترن بلات
1. از نردبان وزن مولکولی از قبل رنگی استفاده کنید
برای ردیابی انتقال پروتئین از ژل به غشاء از یک نردبان پروتئینی از پیش رنگ آمیزی شده استفاده کنید. پروتئین های نمونه شما روی ژل SDS-PAGE همچنان نامرئی خواهند بود، اما می توانید بررسی کنید که آیا نوارهای ستونی رنگ روشن هنوز روی ژل هستند یا به طور کامل به غشاء منتقل شده اند.
توجه داشته باشید که پروتئین هایی با وزن های مولکولی متفاوت با سرعت های متفاوتی مهاجرت می کنند – هیچ لحظه جادویی وجود ندارد که در آن همه پروتئین ها از ژل به غشاء بپرند.
در عوض، نقطه‌ای را هدف قرار دهید که بیشتر پروتئین‌های بزرگ‌تر به غشاء مهاجرت کرده‌اند و بیشتر مواد پروتئینی کوچک هنوز روی غشاء هستند – نه از طریق آن.
استفاده از نردبان که هر نوار رنگ متفاوتی دارد می تواند مفید باشد. این به شما امکان می دهد کارایی انتقال پروتئین های با اندازه های مختلف را کنترل کنید.
به یاد داشته باشید که اگر کاست انتقال خود را برای “نگاه کردن” به نردبان باز کرده باشید، این کار باعث وارد شدن حباب های هوا به پشته انتقال می شود. بنابراین احتمالاً می خواهید از این تکنیک برای بهینه سازی زمان انتقال استفاده کنید – نه هنگام اجرای نمونه های حیاتی.
2. ژل SDS-PAGE خود را با Coomassie Blue رنگ کنید
اما فقط بعد از مرحله انتقال بذار توضیح بدم
راه آسان دیگر برای نظارت بر کارایی انتقال پروتئین، رنگ آمیزی ژل با کوماسی پس از تکمیل انتقال است.
این یک روش سریع و آسان است که به شما ایده خوبی از میزان پروتئین موجود در ژل می دهد.
اگر ژل تقریباً کاملاً خالی باشد، انتقال شما موفقیت آمیز بوده است.
اما اگر بیشتر ژل شما خطوط نمونه آبی را نشان می دهد، انتقال شما باید بیشتر طول بکشد.
باز هم این یک است post hoc بررسی کارایی انتقال هنگامی که ژل را لکه دار کردید، نمی توانید آن را برای انتقال دوم تنظیم کنید. در عوض، باید ژل دوم را اجرا کنید و با استفاده از شرایط تنظیم شده، انتقال را دوباره انجام دهید.
پس حتما این تست را قبل از انتشار نمونه های ارزشمند خود انجام دهید!
3. ژل خود را روی دو غشا انتقال دهید
دو روشی که در بالا توضیح داده شد، راه های بسیار خوبی برای تعیین اینکه آیا مدت زمان انتقال خیلی کوتاه بوده است، هستند.
برای بررسی اینکه آیا انتقال شما خیلی طولانی است، دو غشای انتقال را در پشته انتقال قرار دهید، یکی درست پشت دیگری.
سپس ادامه دهید و طبق معمول هر دو غشا را خیس کنید.
فقط به یاد داشته باشید که برچسب بزنید که از ژل دورتر است!
اگر شرایط انتقال شما خوب باشد، بیشتر پروتئین شما روی غشای نزدیک به ژل خواهد بود.
اگر انتقال شما خیلی طولانی باشد، پروتئین را در دورترین غشای ژل خواهید دید.
این احتمال بیشتر در ابتدا برای پروتئین های کوچک رخ می دهد، بنابراین توجه ویژه ای به محل قرارگیری ستون فقرات با وزن مولکولی پایین داشته باشید. باید ظاهر شود.
همچنین می توانید غشای دوم را با رنگ آبی Coomassie (یا چیزی حساس تر) رنگ آمیزی کنید. این باید تمام پروتئین های منتقل شده به آن لایه را به شما نشان دهد، نه فقط پروتئینی که به آن علاقه دارید.
آیا این نکات برای شما مفید بود؟
ما سه نکته ساده را پوشش داده ایم که می توانید از آنها برای بهینه سازی انتقال وسترن بلات خود استفاده کنید. امیدواریم که این کیفیت و وضوح نقاط شما را بهبود می بخشد و تفسیر آنها را آسان تر می کند و شما را آزاد می کند تا به مسائل تحقیقاتی مهم تر رسیدگی کنید.
آیا این نکات به شما کمک کرد؟ آیا عقلی برای به اشتراک گذاشتن دارید؟ در بخش نظرات زیر به ما اطلاع دهید!
آیا می خواهید تمام دستور العمل های بافر وسترن بلات، دستور معرف ECL و پروتکل آسان را در یک مکان و در نوک انگشتان خود داشته باشید؟ برگه تقلب وسترن بلات رایگان ما را دانلود کنید.
و برای اطلاعات بیشتر در مورد این کنترل های انتقال، این ویدیوی عیب یابی وسترن بلات از Agrisera را ببینید.
در اوت 2011 منتشر شد. بازبینی و بازنویسی در نوامبر 2022 با استفاده از مقالاتی که قبلا توسط Emily Crowe و Joanna Porankiewicz-Asplund ایجاد شده بود.
