آیا تحقیقات شما متوقف شده است زیرا شما سعی در بیان پروتئین نامحلول دارید؟ آیا می توانید این پروتئین را در معرض دید و تصفیه قرار دهید ، اما نمی توانید فعالیت آن را نشان دهید؟
من دو کلمه دارم که می تواند به شما کمک کند: شوک اسمزی. بخوانید تا دریابید که چگونه این تکنیک می تواند شما را در مسیر آزمایش های موفق پروتئین بازگرداند.
شوک هشتم چیست؟
قرار گرفتن در معرض سلولهای باکتریایی در برابر غلظت خارجی بالای اسولیتها (ترکیبات کوچک و محلول که حجم سلول را تنظیم می کنند) ، رشد سلول ها و جداسازی را کند می کند. این امر به این دلیل است که سلولها با استفاده از اسموز آب را به محیط رشد از دست می دهند و منجر به شوک اسمزی SO -Called می شوند. [1]
شوک کشنده نیست و سلول ها در نهایت با آن متعادل می شوند و اسموولیت های خود را سنتز می کنند و جذب می کنند. این مانع از بین رفتن آب می شود و به سلول ها اجازه می دهد تا رشد و تقسیم خود را ادامه دهند (شکل 1). در E. ماشینمتداول ترین میزبان بیان پروتئین ، این اسولیتیت ها شامل پتاسیم ، گلوتامات و تریلوز هستند.
چگونه شوک هشتم باعث افزایش حلالیت و فعالیت پروتئین های بیان شده می شود؟
به طور خلاصه ، هیچ کس با اطمینان نمی داند. این تئوری با بیشترین شواهد در این مورد به اصطلاح است پوستفوبیک نظریهحرف [2] وی ادعا می کند که تعامل شیمیایی بین اسولیتا و اساس پروتئین هدف از نظر انرژی نامطلوب است. تصور می شود که این فعل و انفعالات وقتی پروتئین تاشو می شود ، گسترده تر است به گونه ای که شکل طبیعی و احتمالاً فعال در طول بیان در داخل بدن ترویج می شود.
بازگشت به واقعیت: چگونه یک شوک هشتم را انجام دهیم
همه اینها خوب و خوب است ، اما چگونه این تکنیک را اعمال می کنید؟
خوب ، فقط 500-1000 میلی متر D-Sorbitol را به محیط رشد باکتریایی خود اضافه کنید و طبق معمول ادامه دهید. [3] اوه ، و نگران حل این همه گرد و غبار نباشید ، به طرز جادویی در اتوکلاو ناپدید می شود.
یک مطالعه دیگر گزارش می دهد که گنجاندن 2.5 میلی متر گلیسیل Betaine علاوه بر D-sorbitol با ارائه 427 برابر افزایش فعالیت تست ، نتایج را بهبود می بخشد ، بنابراین می توانید آن را امتحان کنید. [4]
شما می توانید غلظت NaCl و رسانه ای را که انتخاب می کنید تغییر دهید ، زیرا NaCl به خودی خود یک اسمیتیست است. معیار هرگونه تغییر در بیان و فعالیت هدفمند در برابر بیان کنترل و POW! امیدواریم که نتایج خوبی کسب کنید.
همیشه یک ضرر وجود دارد
با این گوهر کوچک تکنیک یک ضرر وجود دارد. در سنتز و مصرف اسمولیل های اضافی ، سلولها وزن متابولیکی قابل توجهی را تجربه می کنند. در نتیجه ، آنها به آرامی رشد می کنند و تقسیم می شوند. واقعاً واقعاً به آرامی بنابراین ، شما برای مدت طولانی منتظر خواهید بود تا محصولات باکتریایی خود به یک چگالی نوری برسید ، که مناسب است برای القای بیان پروتئین هدف شما باشد.
شما می توانید با ترکیب اسولیت ها در فرهنگ حجم کوچک خود ، که قبل از بیان آن را ترمیم می کنید ، تا حدودی بر این امر غلبه کنید. از آنجا که کشت حجم کم معمولاً یک شبه باقی مانده است ، سلول ها می توانند با شرایط شوک هشتم متعادل شوند در حالی که شما با خوشحالی خواب هستید.
اگر برای بیان پروتئین برای همه این موارد تازه کار هستید و این اصطلاحات کمی گیج کننده است ، حتماً به این مقاله عالی در مورد چگالی نوری و این راهنمای بیان پروتئین نگاه کنید.
با این حال ، آماده باشید تا دو یا سه برابر بیشتر از زمانی که در صورت عدم انتخاب اسولیت ها و حتی طولانی تر در صورت انتخاب پلاسمیدهای متعدد با آنتی بیوتیک های متعدد ، صبر کنید.
آیا شوک هشتم برای شما کار می کند؟ آیا آنها اسولیت های اضافی پیدا کرده اند که به پروتئین شما در معرض نمایش کمک می کند؟ اگر چنین است ، حتماً نظر خود را در زیر بگذارید.
و بازی تصفیه پروتئین خود را در سطح بعدی با دو کتاب الکترونیکی رایگان ما بیرون بیاورید: راهنمای زیستی BIO برای بیان پروتئین و پنج روش برای ارزیابی خلوص و کیفیت پروتئین.
ادبیات
- Yancey PH (2001) استرس آب ، اسولیت ها و پروتئین ها. زول هستم 41: 699-709
- Bolen DW و Baskakov IV (2001) اثر اسموفوبیک: انتخاب طبیعی قدرت ترمودینامیکی هنگام تاشو پروتئین ها. J Mol Biol 310: 955-63
- Ogansyan n و همکارانشS (2007) تأثیر استرس اسمزی و شوک حرارتی در بیان بیش از حد نوترکیب و تبلور پروتئین ها. تصفیه خارج از پروتئین 52: 280-5
- Blackwell Jr و Horgan R (1991) یک استراتژی جدید برای تولید پروتئین نوترکیب بسیار بیان شده به شکل فعال. فاش کردن 295: 10-2
